在不速之客马云飞高涵的婚礼当天，——号特工5组的老朋友老俞来了，恳求他们再次出山，执行一项别人无法完成的任务：追查窃取美国核武器材料的双面间谍吉川蒙夫。于是，高涵成了落跑新娘，跟随欧阳建平、李志波到云南接受传教，马云飞、何建也被迫离开了大山。于是《特工5》的五位成员：语言专家欧阳建平、爆破专家李志波、密码专家马云飞、高涵、“神偷”何建，再次齐聚一线。与此同时，日本方面派出了他们的杀手，酒井朝香。她是酒井美子的姐姐，一个手腕更加狠毒的资深女间谍。《特工组5》开局不利，被尚未曝光的吉川猛男陷害入狱。无奈之下，特工5组集体越狱.他一边躲避美军的追击，一边追击吉川的猛男，最终查出了美军内部的叛徒，并在酒井参拜前找到了被盗的核武器资料。随着战事加剧，前方战场的士兵发生了大规模的病毒感染。特工5奉命调查，而这个病毒站的罪魁祸首桥本却走偏了路。桥本也是一个把科学实验看得高于一切的科学怪人。他给阿尔派恩注射了一种病毒，绑架她作为实验品，一路上小心翼翼地保护她。马云飞、李志波、何建深入滇缅边境。经过艰难的丛林追逐，他们发现了敌人在缅甸的生化基地。这时，为了得到病毒血清，高涵几乎献出了自己的生命来拯救前线的大量士兵。战事紧急，正面战场物资短缺。蒋介石瞄准了阎锡山早年藏匿的军火。阎锡山以兵工厂建造者李阳失踪为由，拒绝为蒋介石提供军需。戴笠不得不再次求助于特工5，让马云飞潜入陕西寻找兵工厂的建造者李阳的下落。五号特工利用日军指挥官风间一波对中国画的喜爱，以窃取蒋介石家族的著名古画为诱饵，勾搭上了风间一波。他通过卖画的方式，深入到一波在风间居住的司令部，借机偷拍了日军晋中会战的战记和花名册。这时，酒井也来了，马云飞熟练地变戏法。在被抓前夕，他成功逃离了日本总部。5日，马云飞和何建通过假口供进入康坑桂花监狱。经过许多麻烦，他们终于取得了监狱长朱非的信任，并帮助他越狱。朱非失败了。在他死之前，他告诉马云飞他是李阳。5号终于在日本人之前找到了兵工厂。五号特工带着心爱的国画回到重庆，准备完好无损地还给赵。他一下飞机就遇到了来中国援助的美国飞虎队队长陈纳德，在机场遭到袭击。5号特工组还没来得及下车，就被老俞和戴笠堵在门口。五号从重庆机场枪击案现场，运用物理学、枪械、心理学、推理演绎等知识，从极其有限的线索中还原了枪击现场，并循着线索，彻底瓦解了日军暗杀阴谋。真相大白后，马云飞等人奉命保护陈纳德不得来渝；为了确保陈纳德的安全，陈纳德夫人还邀请了美国安全顾问罗伯特。罗赶到后，将自己的行为归罪于等人，层出不穷的事故也让特工5屡屡陷入被动。马云飞等人几经周折，发现所有事件的真正凶手是由安全顾问罗特造成的。这家伙是个骗子。5号特工接到中国远征军孙立人将军的邀请，要送一份重要的河流地图到缅甸，同行的还有随行记者、马云飞的老同学崔元元。高涵对此很嫉妒。他们都不知道，此时的崔媛媛其实就是被改变后的酒井香香。酒井为了混进远征军基地，配合日军轰炸机实施轰炸，杀死并假扮崔元元跟随5号。高涵是唯一一个当所有人都被好大喜功的酒井送进陷阱，指引日军轰炸机的篝火即将点燃时，离队已久的欧阳建平带着陈纳德的救援赶到了。酒井朝香重复了她姐姐的命运，第五特勤组再次团聚，但高涵和马云飞这对恋人却成了陌生人。